Localizzazione dei trasmettitori e gli enzimi

Perché localizzare i trasmettitori è così importante

Un neurotrasmettitore non basta che esista: per esercitare un effetto deve essere prodotto, accumulato e rilasciato in punti precisi del sistema nervoso. Sapere quali neuroni contengono una data molecola, e dove la concentrano, permette di ricostruire le mappe dei circuiti cerebrali, di capire come una popolazione di cellule comunica con un’altra e di individuare i bersagli su cui agiscono i farmaci. Per molti decenni il limite principale è stato proprio tecnico: le sostanze coinvolte sono presenti in quantità minime e mescolate a migliaia di altre molecole.

La svolta è arrivata quando si è capito che, invece di cercare direttamente il trasmettitore, conviene spesso individuare le tracce della sua produzione. Una cellula che sintetizza una molecola segnale deve possedere gli enzimi specifici per fabbricarla e l’informazione genetica per costruire quegli enzimi. Localizzare gli enzimi, o l’mRNA che li codifica, equivale quindi a identificare i neuroni che usano quel particolare trasmettitore.

L’immunocitochimica: trovare le proteine nel tessuto

L’immunocitochimica è un metodo che serve a localizzare molecole specifiche, in particolare le proteine, all’interno di sezioni di tessuto nervoso. Si fonda sul principio della riconoscibilità immunitaria: il sistema immunitario produce anticorpi capaci di legarsi in modo altamente selettivo a una determinata molecola, detta antigene. Se si dispone di un anticorpo diretto contro una proteina di interesse, lo si può usare come una sonda mirata che si attacca solo a quella proteina e a nessun’altra.

Nella pratica si prepara una sottile sezione di tessuto e la si espone all’anticorpo specifico. L’anticorpo si lega esclusivamente alla proteina bersaglio, là dove essa è presente. A questo punto bisogna rendere visibile il legame: di solito si ricorre a un secondo anticorpo coniugato a un marcatore, per esempio una molecola fluorescente o un enzima che produce un prodotto colorato. Osservando il preparato al microscopio, i punti marcati indicano con precisione la posizione della proteina.

Cosa si individua davvero con questa tecnica

L’immunocitochimica non rivela il trasmettitore in quanto tale, ma le proteine collegate alla sua vita cellulare: tipicamente gli enzimi che lo sintetizzano, le proteine che lo trasportano nelle vescicole o i recettori che lo riconoscono. Individuando, per esempio, l’enzima che produce un dato neurotrasmettitore, si deduce che quei neuroni sono in grado di fabbricarlo. È questo collegamento indiretto, dalla proteina alla funzione, a rendere la tecnica così potente nello studio dei circuiti.

L’ibridazione in situ: seguire l’mRNA

L’ibridazione in situ è invece un metodo per localizzare gli specifici mRNA trascritti per le proteine. Anziché cercare il prodotto finito, cioè la proteina, va a colpire l’istruzione che la cellula sta usando per costruirla. Quando un neurone produce un enzima, prima trascrive il gene corrispondente in una molecola di mRNA: trovare quell’mRNA significa dimostrare che la cellula sta effettivamente attivando quel gene.

La tecnica sfrutta la complementarità delle sequenze degli acidi nucleici. Si costruisce una sonda, un breve filamento di acido nucleico la cui sequenza è complementare a quella dell’mRNA cercato. La sonda viene marcata, in passato con un isotopo radioattivo, oggi più spesso con un marcatore non radioattivo. Applicata al tessuto, la sonda si appaia in modo specifico al proprio mRNA bersaglio, restando ancorata solo nelle cellule che lo contengono. Il segnale del marcatore indica quindi quali neuroni stanno trascrivendo quel determinato gene.

Il ruolo degli enzimi nella mappatura

Gli enzimi sono i protagonisti silenziosi di questa indagine. Ogni neurotrasmettitore è il risultato di una via biosintetica catalizzata da enzimi specifici, presenti solo nei neuroni che usano quella molecola. Per questo gli enzimi di sintesi sono marcatori affidabili dell’identità chimica di un neurone: trovarne uno equivale a etichettare la cellula come appartenente a un certo sistema di trasmissione. Sia l’immunocitochimica, che individua l’enzima come proteina, sia l’ibridazione in situ, che ne individua l’mRNA, convergono su questo stesso obiettivo da due direzioni diverse.

Due tecniche complementari, non alternative

Immunocitochimica e ibridazione in situ rispondono a domande leggermente diverse e proprio per questo si completano. La prima mostra dove la proteina è effettivamente presente e accumulata, fornendo una fotografia del prodotto maturo. La seconda mostra dove il gene è attivo, cioè dove la cellula sta producendo l’istruzione per quella proteina in quel momento. Combinandole, i ricercatori possono distinguere un neurone che possiede una proteina da uno che la sta attivamente sintetizzando, e ricostruire così non solo la mappa statica dei trasmettitori ma anche la loro dinamica di produzione.

L’impiego congiunto delle due metodiche ha permesso di costruire atlanti dettagliati dei sistemi di neurotrasmettitori nel cervello, di seguire i cambiamenti dell’espressione genica in risposta a stimoli o farmaci e di chiarire il coinvolgimento di specifiche popolazioni neuronali in numerose patologie.

Dalla mappa chimica alla pratica clinica e ai limiti del metodo

La possibilità di sapere quali neuroni producono un certo trasmettitore non è solo un esercizio descrittivo: ha trasformato il modo in cui si studiano le malattie del sistema nervoso. Conoscere la distribuzione precisa di una popolazione neuronale permette di capire cosa accade quando quella popolazione si altera. La perdita selettiva dei neuroni che producono un dato trasmettitore, per esempio, è alla base di diverse condizioni neurologiche, e poterli identificare con esattezza è il primo passo per studiarne il decorso e immaginare possibili terapie.

Allo stesso modo, sapere dove si trovano i recettori e gli enzimi di un sistema di trasmissione aiuta a prevedere dove agirà un farmaco e quali effetti, desiderati o collaterali, potrà produrre. Queste tecniche sono quindi uno strumento di base sia per la ricerca farmacologica sia per la comprensione dei meccanismi delle malattie.

Va però ricordato che ogni metodo ha i suoi limiti. La specificità del risultato dipende dalla qualità della sonda o dell’anticorpo impiegato: un reagente poco selettivo può legarsi anche a molecole simili e generare segnali ingannevoli. Inoltre, la presenza di un enzima o di un mRNA non garantisce sempre che il trasmettitore venga effettivamente prodotto e rilasciato in quantità funzionalmente rilevanti. Per questo i ricercatori incrociano i risultati di più tecniche e li interpretano con cautela, evitando di trarre conclusioni da un singolo segnale.

Domande frequenti

Qual è la differenza fondamentale tra immunocitochimica e ibridazione in situ?

L’immunocitochimica localizza le proteine, sfruttando anticorpi che riconoscono in modo selettivo la molecola bersaglio. L’ibridazione in situ localizza invece l’mRNA, cioè l’istruzione genetica da cui la proteina viene costruita, usando sonde di acido nucleico complementari. La prima mostra il prodotto finito, la seconda l’attività del gene.

Perché si cercano gli enzimi invece dei neurotrasmettitori stessi?

Molti neurotrasmettitori sono presenti in quantità minime, sono diffusi anche in altre cellule e risultano difficili da fissare nel tessuto. Gli enzimi che li sintetizzano, al contrario, sono specifici dei neuroni che usano quella molecola e sono proteine ben riconoscibili. Trovare l’enzima, o l’mRNA che lo codifica, è quindi un modo affidabile per identificare i neuroni che producono un certo trasmettitore.

Come si rende visibile al microscopio il legame della sonda o dell’anticorpo?

Si ricorre a marcatori applicati alla sonda o all’anticorpo: molecole fluorescenti che emettono luce, enzimi che generano un prodotto colorato o, in passato, isotopi radioattivi rilevati su lastra. Al microscopio, le zone marcate corrispondono ai punti del tessuto in cui la proteina o l’mRNA cercati sono presenti.

Le due tecniche possono essere usate insieme?

Sì, e spesso conviene. Usandole sullo stesso tessuto si può confrontare dove un gene è attivo con dove la proteina corrispondente si accumula. Questo permette di distinguere i neuroni che semplicemente contengono una molecola da quelli che la stanno producendo, offrendo un quadro più completo del funzionamento dei circuiti.